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Jul 03, 2023

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Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 583 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Fähigkeit, Zellchemie im Nanomaßstab abzubilden, ist für das Verständnis der Zellbiologie von entscheidender Bedeutung, viele optische Mikroskope sind jedoch durch die Beugungsgrenze von ~(200–250) nm eingeschränkt. Elektronenmikroskopie und hochauflösende Fluoreszenztechniken überwinden diese Grenze, verlassen sich jedoch auf Färbung und spezielle Markierung, um Bildkontrast zu erzeugen. Daher ist es eine Herausforderung, Informationen über die funktionelle Chemie intrazellulärer Komponenten zu erhalten. Hier demonstrieren wir eine Technik zur intrazellulären, markierungsfreien chemischen Kartierung mit nanoskaliger (~30 nm) Auflösung. Wir verwenden ein sondenbasiertes optisches Mikroskop, das mit einem Laser im mittleren Infrarotbereich beleuchtet wird, dessen Wellenlängen Schwingungsmodi funktioneller Gruppen anregen, die in biologischen Molekülen vorkommen. Zur Demonstration kartieren wir intrazelluläre Strukturen in menschlichen Zellen des multiplen Myeloms chemisch und vergleichen die Morphologien mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen derselben Zelllinie. Wir demonstrieren auch die markierungsfreie Kartierung bei Wellenlängen, die so ausgewählt wurden, dass sie auf die chemischen Signaturen von Proteinen und Nukleinsäuren abzielen, und zwar auf eine Weise, die zur Identifizierung biochemischer Marker bei der Untersuchung von Krankheiten und Pharmakologie verwendet werden kann.

Der Standardweg zu ultrastrukturellem Wissen, die Elektronenmikroskopie (EM), verwendet mit Schwermetallen gefärbte Proben, um Elektronenabsorptionskontrast und elektrische Leitfähigkeit zu erzeugen. Sie werden in der Regel in Harz eingebettet, um dem Elektronenbeschuss im Vakuum in einem mehrtägigen Prozess standzuhalten. Darüber hinaus liefern EM-Bilder in Ermangelung einer sehr spezifischen Immunmarkierung nur morphologische Informationen und zeigen nur Ultrastrukturmerkmale, die die Färbung annehmen.

Eine Vielzahl hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht auch die Subbeugungsbildgebung von Zellstrukturen1,2, aber alle erfordern Markierungen, die spezifisch für das jeweilige Problem sind und für eine effektive Markierung häufig auf Vorkenntnissen der Strukturen angewiesen sind. In der Praxis schränkt das Photobleichen der Fluorophore sowie Probleme mit der Stabilität und Spezifität die Genauigkeit ein, mit der Markierungen lokalisiert werden können. Selbst wenn solche technischen Herausforderungen überwunden werden, ist die Fähigkeit, Strukturen zu lokalisieren, durch den Abstand zwischen der Zielstruktur und dem Fluorophor begrenzt, der durch die Länge der verwendeten Fluoreszenzmarkierungen und Verbindungsmoleküle bestimmt wird, die typischerweise jeweils mehrere Nanometer betragen3. Entscheidend ist auch, dass durch die Kennzeichnung die Biologie der Proben gestört wird1.

Infrarotspektroskopie (IR) und Bildgebung werden häufig zur Gewinnung quantitativer, markierungsfreier chemischer Informationen eingesetzt, die Beugungsgrenze macht eine Bildgebung auf intrazellulärer Ebene jedoch im Allgemeinen unmöglich. Um diese Grenze zu überschreiten, wurden mehrere sondenbasierte Bildgebungstechniken entwickelt, die das nanoskalige Auflösungsvermögen der Rasterkraftmikroskopie (AFM) mit der chemischen Empfindlichkeit der IR-Spektroskopie kombinieren4,5. Wir verwenden optische Nahfeldmikroskopie vom Streuungstyp (s-SNOM), bei der die AFM-Sonde von einem abstimmbaren IR-Laser beleuchtet wird. Durch das Sammeln und Analysieren des IR-Lichts, das von dem kleinen Bereich, in dem Spitze und Probe interagieren, zurückgestreut wird, können wir auf die IR-Absorptionseigenschaften des Probenmaterials in diesem Bereich schließen. Durch die Abstimmung des Lasers können wir Bilder mit chemischer Spezifität erstellen, ohne dass eine Anfärbung oder Markierung erforderlich ist. Wichtig ist, dass wir das biologische Material selbst abbilden. Wir erkennen ultrastrukturelle Merkmale, die noch nie zuvor direkt mit Licht abgebildet wurden, was die Möglichkeit erhöht, neue intrazelluläre Strukturen zu finden, die im EM nicht sichtbar sind.

s-SNOM wurde zuvor zur Abbildung isolierter biologischer Proben wie Proteinkomplexe6,7,8, Viren9 und Amyloidfibrillen10 sowie zur Oberflächenabbildung ganzer Zellen11,12,13 eingesetzt. Intrazelluläre Strukturen in Zellen und Gewebe wurden auch in einzelligen Organismen14 bzw. Zebrafisch-Netzhautgewebe15 abgebildet. Hier bauen wir darauf auf, indem wir intrazelluläre Strukturen in menschlichen Zellen des multiplen Myeloms chemisch kartieren, einschließlich, nach Kenntnis der Autoren, der ersten direkt optischen Subbeugungsbilder des endoplasmatischen Retikulums (ER), der Mitochondrien (Mt) und der fibrillären Komponenten in Nukleolen. Indem wir die Beleuchtungswellenlänge variieren, um verschiedene chemische Gruppen in den Zellen anzusprechen, demonstrieren wir auch die Isolierung der Ultrastruktur auf eine Weise, die traditionell nur durch hochspezifische Markierung erreicht wird.

In unserem s-SNOM-Aufbau (Abb. 1) beleuchtet ein Quantenkaskadenlaser (QCL) im mittleren Infrarotbereich eine scharfe leitfähige Sonde, die aufgrund des sogenannten Blitzableitereffekts an ihrer Spitze ein verstärktes und sehr lokalisiertes optisches Feld aufbaut16 ,17. Das Vorhandensein der Probe verändert dieses Feld, so dass die lokalen IR-Absorptionseigenschaften der Probe aus dem rückgestreuten Licht wiederhergestellt werden können18. Insbesondere bei schwachen Oszillatoren wie den hier untersuchten Schwingungsmoden ist die Phase des rückgestreuten Lichts proportional zum Dämpfungsterm des komplexen Brechungsindex und somit auch proportional zum Fernfeldabsorptionskoeffizienten bei der jeweiligen Abbildungswellenlänge19. Entscheidend ist, dass die räumliche Auflösung von Bildern durch die Größe der Sondenspitze und nicht durch die Wellenlänge des Lichts bestimmt wird16,20, was es uns ermöglicht, die Beugung bei unserer Bildwellenlänge von \(\sim\)6 µm typischerweise um zwei Größenordnungen zu übertreffen .

Das Licht des Infrarot-Quantenkaskadenlasers (QCL) (IR) wird mit einem Strahlteiler (BS) in zwei Arme aufgeteilt. Ein Arm wird mit einem Parabolspiegel (PM) auf eine scharfe Metallsonde fokussiert, die mit der Frequenz Ω über einer Probe schwingt. Der andere Arm wird durch einen Schwingspiegel (VM) mit der Frequenz M phasenmoduliert und dient als Referenzstrahl. Das von der Sonde und dem Referenzstrahl zurückgestreute Licht wird mit einem Quecksilber-Cadmium-Tellurid-Detektor (MCT) erfasst, während die Probe auf einem piezoelektrischen Tisch rasterabgetastet wird. Die optischen Eigenschaften der Probe werden aus dem rückgestreuten Licht wiederhergestellt.

Hier entscheiden wir uns dafür, die Technologie auf Zellen des multiplen Myeloms anzuwenden, da sie ein Beispiel für eine wichtige menschliche Krankheit sind, bei der die entscheidenden Pathologiemechanismen auf der Ebene einzelner Zellen ablaufen21, was sie für unseren Ansatz besonders geeignet macht. Sie sind auch mit Transmissions-EM (TEM)22,23 gut untersucht. Die Zellen werden fixiert, in Epoxidharz eingebettet und auf (70–200) nm geschnitten, jedoch nicht osmiert, um eine markierungsfreie Bildgebung zu ermöglichen. Für die s-SNOM-Bildgebung verwendete Abschnitte werden auf einem Siliziumsubstrat platziert, dessen Reflexionsvermögen das Signal verstärkt und die Bildqualität verbessert24. Einzelheiten zur Wahl der Abschnittsdicke und zur Wirkung eines reflektierenden Substrats finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 1 bzw. 2. Zusätzliche Zellabschnitte werden mit Uranylacetat und Bleicitrat nachgefärbt und mit TEM abgebildet, um die s-SNOM-Bilder zu vergleichen.

Von entscheidender Bedeutung für die Technik ist ein Pseudo-Heterodyn-Erkennungsschema25. Das am Detektor gemessene Signal wird bei Harmonischen der Sondenschwingungsfrequenz Ω analysiert, die in Seitenbänder aufgeteilt werden, die durch die Phasenmodulationsfrequenz M des vibrierenden Referenzspiegels getrennt sind. Für die in diesem Artikel präsentierten Bilder wird die dritte Harmonische der Sondenschwingungsfrequenz verwendet. Dies ergibt eine hoch oberflächenempfindliche, hintergrundfreie Phasenmessung, \({\phi }_{3}\). Die dritte Harmonische wird gewählt, da niedrigere Harmonische im Allgemeinen durch ein Hintergrundsignal verunreinigt sind, während höhere Harmonische ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen. Der Vollständigkeit halber ist in der ergänzenden Abbildung 1 eine Reihe von Bildern aufgeführt, die bei jeder verfügbaren Harmonischen n gesammelt wurden. Zusätzlich zu den Phasenmessungen ruft das s-SNOM-System auch optische Amplituden- und Probentopographiemessungen ab. Repräsentative Karten dieser Größen und eine Erläuterung der darin enthaltenen Informationen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 2.

Abbildung 2a ist ein s-SNOM-Bild einer Myelomzelle, aufgenommen bei 1667 cm−1, einer Wellenlänge, die Schwingungsmoden in den Amideinheiten anregt, die in Proteinen und Nukleobasen vorhanden sind. Die gemessene Phasenverschiebung \({\phi }_{3}\) ist proportional zur Probenabsorption und damit bei dieser Wellenlänge zur Amiddichte. Die morphologischen Merkmale in der resultierenden chemischen Karte ermöglichen die Identifizierung mehrerer intrazellulärer Strukturen, einschließlich eines mehrlappigen Kerns, der von einer Kernmembran (NM) umrandet wird und einen Nukleolus (Nuc) enthält. Ähnliche ultrastrukturelle Merkmale werden im TEM-Bild einer Myelomzelle beobachtet (Abb. 2b), was die Identifizierung von Strukturen unterstützt.

eine chemische s-SNOM-Kartierung von Myelomzellen, aufgenommen bei 1667 cm−1, die auf Amidgruppen in Proteinen und Nukleobasen abzielt. Die Einfügungen a(i) und a(ii) sind s-SNOM-Bilder mit höherer Auflösung. b, c TEM von Myelomzellen, die mit Uranylacetat und Bleicitrat nachgefärbt, aber nicht osmiert wurden. Die Einschübe c(i) und c(ii) zeigen Strukturen detaillierter. d Räumliches Profil des s-SNOM-Signals entlang der roten Linie in a(ii). NM-Kernmembran, Nuc nucleolus, ER endoplasmatisches Retikulum, Mt-Mitochondrien. Maßstabsbalken 2 µm (a, b), 1 µm (c) und 500 nm (a(i), a(ii), c(i), c(ii)).

Die höchste Amidabsorption findet im Nukleolus statt. Dies ist der Ort der Ribosomenbiogenese, die auf vielen Proteinen beruht, darunter Fibrillarin, Nukleolin und Nukleophosmin26,27,28. Die Kernmembran ist außerdem reich an Protein29 und weist daher bei der chemischen Kartierung eine hohe Amidabsorption auf. Das körnige Muster innerhalb der Kernhülle ist Chromatin, bestehend aus eng um Histonproteine ​​gewickelter DNA30.

Höher aufgelöste s-SNOM-Bilder (Abb. 2a (i und ii)) zeigen Strukturen, die wir als ER und Mt identifizieren und die bei dieser Wellenlänge aufgrund ihres Protein- und Nukleinsäuregehalts sichtbar sind31,32. Eine ähnliche Morphologie ist in TEM-Bildern von ER und Mt in Abb. 2c (i und ii) zu beobachten, was unsere Identifizierung erneut unterstützt.

Abbildung 2d zeigt einen Linienscan des s-SNOM-Signals entlang der roten Linie in Abb. 2aii, die den Rand eines Mitochondriums kreuzt. Das räumliche Profil wird über eine Breite von 6 nm (3 Pixel) gemittelt und weist eine räumliche Auflösung von ≈30 nm auf. Dieses Maß an räumlicher Auflösung wird routinemäßig mit diesen biologischen Proben erreicht (ergänzende Abbildung 3), wir gehen jedoch davon aus, dass eine weitere Optimierung der Bildgebungstechnik zu einer Verbesserung dieser Auflösung führen würde. Beispielsweise wurden s-SNOM-Auflösungen von bis zu ~5 nm bei anorganischen Proben mit schärferen, maßgeschneiderten Sonden berichtet33.

Abbildung 3a ist ein Fernfeld-Absorptionsspektrum von Myelomzellschnitten, die mit einem formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Protokoll (FFPE) hergestellt, auf eine Dicke von 1 µm geschnitten und anschließend so entparaffiniert wurden, dass die gemessene Absorption keine Abweichungen aufweist Beitrag des Einbettungsmediums. Wir nutzen dieses Fernfeld-Absorptionsspektrum als Grundlage für die Wahl der Wellenlänge für die chemische Kartierung mit s-SNOM.

a Absorptionsspektrum von entparaffinierten, formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Myelomzellabschnitten. b(i–iv) s-SNOM-Bilder einer einzelnen Myelomzelle, aufgenommen bei Wellenlängen aus jeder der in (a) angegebenen Banden. Maßstabsbalken 2 μm.

Die Amid I- und II-Absorptionsbanden sind Aggregate vieler Schwingungsmoden, die von Amideinheiten gezeigt werden, und werden routinemäßig in der IR-Spektroskopie zur Analyse des Proteingehalts von Proben34 verwendet, einschließlich in nanoskaligen Studien mit s-SNOM10,14. Die Phosphodiester (PO2)-Bande entspricht den PO2-Einheiten, die in den Grundgerüsten von Nukleinsäuren und Phospholipiden vorkommen. Seine relative Konzentration kann als zuverlässiger Biomarker für Krebs verwendet werden35. Die mit C–O bezeichnete Bande besteht überwiegend aus C–O-Schwingungsmoden in Ribose, dem Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen in Nukleinsäuren, sowie Lipiden und Kohlenhydraten. Während eine Vielzahl von Makromolekülen auch zur Absorption in den PO2- und CO-Banden in verschiedenen Zellregionen beitragen können, werden beide routinemäßig zur Analyse des Nukleinsäuregehalts in der Kernregion verwendet34. Wir stellen fest, dass ein Großteil des Lipidgehalts aus den Zellen entfernt wird, wenn sie mit Xylol gereinigt werden, was das Fehlen eines Absorptionspeaks bei etwa 1730 cm−1 erklärt. Der Vollständigkeit halber ist in der ergänzenden Abbildung 4 ein Absorptionsspektrum der in Harz eingebetteten Myelomzellen dargestellt, die für die s-SNOM-Bildgebung verwendet werden.

Abbildung 3b zeigt die chemische Kartierung einer einzelnen Myelomzelle bei Wellenlängen, die jeden der vier Absorptionspeaks in Abb. 3a darstellen. Abbildung 3bi am Amid-I-Peak dient in erster Linie dazu, die Proteindichte in der gesamten Zelle abzubilden, obwohl auch Nukleobasen Beiträge leisten. Die Allgegenwärtigkeit von Proteinen in den Zellen führt dazu, dass die gesamte Zelle eine starke Absorption aufweist, verglichen mit dem Einbettungsharz, das bei dieser Wellenlänge nur schwach absorbiert.

Die stärkste Absorption ist in proteindichten Strukturen wie dem Nukleolus und der Kernmembran zu beobachten, wie in Abb. 2a. Abbildung 3bii zeigt auch amidhaltige Strukturen, hier unter Verwendung einer Wellenlänge im Amid-II-Band. Die gleichen Strukturen sind in der Zelle zu sehen, jedoch bei geringeren Gesamtabsorptionsniveaus, was dem Unterschied in den Peakhöhen im Absorptionsspektrum in Abb. 3a entspricht.

Abbildung 3b (iii und iv) sind chemische Karten, die mit Wellenlängen im PO2- bzw. CO-Band aufgenommen wurden. Bei beiden Wellenlängen zeigt sich eine starke Absorption in der Nähe der Kernmembran und an den Peripherien der Nukleolen, was wir hauptsächlich auf dicht gepackte Nukleinsäuren im Chromatin zurückführen30. Das Zytoplasma und die Nukleolen weisen bei 1235 cm−1 eine stärkere Absorption auf als bei 1020 cm−1. Wir führen dies auf das Vorhandensein von Phospholipiden29 zurück, bei denen viele vibronische Moden bei 1235 cm−1 aktiv sind, bei 1020 cm−1 jedoch weitaus weniger am Rand des CO-Bandes34. Wir vermuten daher, dass 1020 cm−1 die geeignetere Bildgebungswellenlänge zur Isolierung von Nukleinsäuren ist.

Chemische Karten mit höherer Auflösung und Abbildungswellenlängen in den Amid-I- und CO-Banden sind in Abb. 4a bzw. b dargestellt. Diese Zelle scheint zweikernig zu sein, wie es häufig bei Zellen des multiplen Myeloms beobachtet wird36,37,38,39, mit zwei proteindichten Nukleolen und Kernmembranen, die in Abb. 4a sichtbar sind. Ein stärker vergrößertes Bild eines der Nukleolen (Abb. 4a (i)) zeigt mehrere hufeisenförmige Strukturen mit hoher Amiddichte, die Bereiche mit geringerer Amiddichte umgeben. Wir identifizieren diese als dichte fibrilläre Komponenten (DFCs) bzw. fibrilläre Zentren (FCs)40. Der Rest des Nukleolus besteht aus einer körnigen Komponente40. Hochvergrößerte TEM-Bilder von Nukleolen (ergänzende Abbildung 5) zeigen auch DFCs und FCs, was unsere Identifizierung unterstützt. Weitere stark vergrößerte Bilder von Nukleolen, die mit s-SNOM aufgenommen wurden, sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 6 und 7. Interessanterweise sind DFCs in Abb. 4b (i) nicht zu sehen, was darauf hindeutet, dass sie bei einer Wellenlänge von 1020 cm−1 nur eine geringe Absorption aufweisen. Dies wird in Abb. 4c durch die räumlichen Profile des s-SNOM-Signals bei beiden Bildwellenlängen über einen DFC bestätigt (magentafarbene Linie in Abb. 4a (i)).

Chemische s-SNOM-Kartierung einer einzelnen Myelomzelle mit Bildwellenlängen in den Amid-I- (a) und CO-Banden (b). Die Einschübe a(i) und b(i) zeigen Strukturen detaillierter. FC fibrilläres Zentrum, DFC dichte fibrilläre Komponente. Räumliche Profile des s-SNOM-Signals entlang der magentafarbenen (c) und grünen (d) Linie bei beiden Bildwellenlängen, gemittelt über eine Breite von 75 nm (5 Pixel). Maßstabsbalken 3 µm (a, b) und 500 nm (a(i), b(i)).

Bemerkenswert ist, dass es auch Bereiche mit hoher Nukleinsäuredichte gibt, die in Abb. 4b(i) durch cyanfarbene Pfeile gekennzeichnet sind und in der Amidkartierung in Abb. 4a(i) nicht erkannt werden, was darauf hindeutet, dass sie eine niedrige Amiddichte aufweisen. Dies wird in Abb. 4d durch die räumlichen Profile des s-SNOM-Signals entlang der grünen Linie in Abb. 4b(i) bestätigt. Weitere Beispiele für die Isolierung von Teilmengen der Zellstruktur auf diese Weise sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 6 und 7. In der ergänzenden Abbildung 8 zeigen wir, dass die IR-Signatur des Einbettungsharzes unsere Fähigkeit zur Abbildung mit chemischer Spezifität nicht merklich beeinträchtigt.

Wir haben s-SNOM verwendet, um eine markierungsfreie chemische Kartierung eukaryotischer Zellen durchzuführen und dabei nanoskalige, sondenbasierte Bildgebung mit der chemischen Empfindlichkeit der IR-Spektroskopie zu kombinieren. Durch die Untersuchung der Morphologie chemischer Karten von Zellen haben wir viele intrazelluläre Strukturen identifiziert und diese durch den Vergleich mit unterstützenden TEM-Bildern validiert. Nach Kenntnis der Autoren liefert dieser Artikel die ersten direkten optischen Subbeugungsbilder von ER, Mt, DFCs und fibrillären Zentren in Nukleolen.

Darüber hinaus haben wir Proteine ​​und Nukleinsäuren in Zellen kartiert, indem wir auf ihre gut verstandenen und weit verbreiteten IR-Signaturen abzielten. Dadurch konnten Teilmengen der Zellultrastruktur isoliert werden, beispielsweise proteinreiche DFCs und Regionen mit hohem Nukleinsäuregehalt in Nukleolen.

Die Quantifizierung intrazellulärer Strukturen – in Anzahl, Größe und chemischer Zusammensetzung – ist ein wichtiger Aspekt der Mikroskopie. Während dies mit markierten Zellen in hochauflösenden Fluoreszenztechniken möglich ist, hat sich gezeigt, dass die Markierungsdichte sowohl die Anzahl der beobachteten Strukturen als auch deren scheinbare Größe beeinflusst41. Die markierungsfreie Natur von s-SNOM bedeutet andererseits, dass die chemische Kartierung vollständig quantitativ sein kann und ohne solche Markierungsverzerrungen erfolgt. Darüber hinaus ist auch die Konvertierung von s-SNOM-Signalen in häufig verwendete optische Parameter wie den Brechungsindex durch Bildverarbeitungsalgorithmen möglich13.

Wir glauben, dass diese Fähigkeit zur quantitativen intrazellulären Bildgebung ein erhebliches Potenzial für die Entdeckung nanoskaliger Biomarker von Krankheiten42 sowie für die Charakterisierung der Wirksamkeit und Wirkmechanismen einer breiten Palette von Therapeutika bietet, insbesondere von Medikamenten wie Bortezomib und Osimertinib43, die im Allgemeinen unterschiedliche Eigenschaften haben chemische Signaturen, die mit s-SNOM ausgenutzt werden können. Korrelative s-SNOM- und Lichtmikroskopie wurden bereits demonstriert15, und wir gehen davon aus, dass eine zusätzliche Korrelation mit EM auch durch Anpassungen aktueller Techniken möglich ist44,45. Wir gehen daher davon aus, dass s-SNOM EM- und hochauflösende Fluoreszenztechniken ergänzen kann, um zum Verständnis der zellulären Mechanismen in einer Vielzahl von Forschungsbereichen beizutragen, darunter auch bei Immunreaktionen wie NETosis46.

Bei unserer Betriebswellenlänge von ~6 µm ist unsere Auflösung von ~30 nm bereits ~100-mal besser als die Beugungsgrenze. Da die maximal erreichbare räumliche Auflösung bei s-SNOM von der Größe der Spitze der Rastersonde abhängt20, kann bei Verwendung einer schärferen Spitze eine bessere Auflösung erwartet werden, allerdings zu Lasten des Signal-Rausch-Verhältnisses des Bildes. Entwicklungen, die zu einer verbesserten Empfindlichkeit bei der s-SNOM-Bildgebung führen, beispielsweise der Einsatz von IR-Nanoantennen8 oder Spitzenverstärkungstechniken47, könnten dazu beitragen, dieses Signal-Rausch-Problem zu lindern. Wir erwarten auch, dass das Experimentieren mit Probenvorbereitungsschemata, die sowohl die morphologischen als auch die chemischen Informationen besser bewahren, zu einer Verbesserung der Bildauflösung in Richtung der in anorganischen Proben angegebenen ~1 nm führen würde48.

Da s-SNOM unter Umgebungsbedingungen mit nur wenigen Milliwatt IR-Leistung durchgeführt wird, müssen die Proben nicht in Harz eingebettet werden, und die Technologie sollte für die Abbildung von Abschnitten im FFPE-Stil geeignet sein42. Letztere werden routinemäßig zu einem Bruchteil der Zeit und Kosten von EM-Proben für die Histopathologie vorbereitet. Dies könnte zu wichtigen klinischen Anwendungen führen, bei denen der routinemäßige Zugriff von Histopathologen auf ultrastrukturelle Informationen ohne Änderung des Arbeitsablaufs die Überwachung von Krankheitsmarkern erheblich verbessern könnte.

RPMI-8226-Zellen wurden in einem RPMI 1640-Medium gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt war, wie von Zlei et al.49 durchgeführt. Die Zellen wurden von der American Type Culture Collection erworben, jährlich durch kurze Tandem-Wiederholungsanalysen verifiziert und alle 3–4 Monate auf Mykoplasmen untersucht.

Um s-SNOM- und TEM-Bildgebung von RPMI-Zellen durchzuführen, wurden 25 × 106 Zellen pelletiert, in 0,1 m 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Puffer (pH 7,2) gewaschen und mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert HEPES für 2 Stunden bei 4 °C und 3 × 10 Minuten mit HEPES gewaschen. Danach wurden die Pellets in einer abgestuften Ethanolkonzentration (50 %, 70 %, 95 % und trocken 100 % v/v) 3 × 5 Minuten lang und anschließend 3 × 10 Minuten lang in Acetonitril (Sigma-Aldrich, UK) dehydriert. Die Proben wurden dann nach und nach mit 50 %, 75 % und 100 % Lösungen von Quetol-Harz (Sigma) in Acetonitril bei RT infiltriert (2 Stunden × 50 % Harz, über Nacht × 75 % Harz und 2 × Wechsel von 100 % Harz darüber). drei Tage) und 24 h bei 60 °C ausgehärtet. Ausgewählte Proben wurden mit 5 % Uranylacetat (UA, 5 Min.) und Bleicitrat (LC, 3 %, 5 Min.) nachgefärbt, beides in bidestilliertem Wasser. Die eingebetteten Pellets wurden mit einem Leica UC7-Ultramikrotom (Leica, Österreich) mit einem 35°-Diamantmesser (Diatome, Schweiz) auf eine Dicke von (70–200) nm geschnitten. Die Schnitte wurden sofort auf kohlenstoffbeschichteten TEM-Kupfergittern (Agar Scientific, UK) oder auf Siliziumwaferchips (NanoAndMore) gesammelt, dann getrocknet und bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Um ein Fernfeld-Absorptionsspektrum zu erhalten, wurden RPMI-8226-Zellen mit einem Standard-FFPE-Protokoll hergestellt. Zum Schneiden von Schnitten mit einer Dicke von 1 µm wurde ein Leica 1400-Mikrotom (Leica, Deutschland) mit einer 22°-Edelstahlklinge (S22, Feather, Japan) verwendet. Die Schnitte wurden auf einen Calciumfluorid-Objektträger gelegt und mit Xylol (2 × 3 Min.) und anschließend mit Ethanol (100 %, 2 × 3 Min.) entparaffiniert.

Ein kommerzielles Nahfeldmikroskopsystem (neaSNOM, NeaSpec, Deutschland), ausgestattet mit einem QCL-System (MIRcat-QT, Daylight Solutions, USA) mit vier Laserchips, die einen Spektralbereich von \(\sim\)(900–1900) cm abdecken −1 wurde für die s-SNOM-Bildgebung verwendet. Um hintergrundfreie Phasenmessungen zu erhalten, wurde ein Pseudoheterodyn-Detektionsschema25 eingesetzt. Im Handel erhältliche Sonden (Arrow NCPt, NanoWorld, Schweiz) mit der Resonanzfrequenz \(\sim\)285 kHz wurden im Tapping-Modus mit \(\sim\)50 nm Amplitude betrieben. Gwyddion wurde für die grundlegende Bildverarbeitung verwendet, beispielsweise zur Korrektur von Linienrauschen und zum Extrahieren von Linienprofilen aus Bilddaten.

Die TEM-Bildgebung von Myelomzellen wurde bei 120 kV (JEOL 2100 TEM, JEOL) durchgeführt.

Das Fernfeldabsorptionsspektrum von Myelomzellen wurde mit einem kommerziellen Fourier-Transformations-IR-Spektrometer (Vertex 70, Bruker, USA) mit Hyperion-IR-Mikroskopaufsatz erhalten, der im Transmissionsmodus betrieben wurde.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

s-SNOM- und TEM-Bilder sind im BioImage Archive-Repository mit dem Zugangscode S-BIAD612 verfügbar. Rohdaten der Absorptionsspektren sind unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22277086.v1 verfügbar. Ergänzende Informationen finden Sie in einem separaten Dokument.

Sahl, SJ, Hell, SW & Jakobs, S. Fluoreszenznanoskopie in der Zellbiologie. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 18, 685–701 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sigal, YM, Zhou, R. & Zhuang, X. Visualisierung und Entdeckung zellulärer Strukturen mit hochauflösender Mikroskopie. Wissenschaft 361, 880–887 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hink, MA et al. Strukturdynamik von grün fluoreszierendem Protein allein und fusioniert mit einem einkettigen Fv-Protein*. J. Biol. Chem. 275, 17556–17560 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Centrone, A. Infrarotbildgebung und Spektroskopie jenseits der Beugungsgrenze. Annu. Rev. Anal. Chem. 8, 101–126 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Dazzi, A. & Prater, CB AFM-IR: Technologie und Anwendungen in der nanoskaligen Infrarotspektroskopie und chemischen Bildgebung. Chem. Rev. 117, 5146–5173 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Berweger, S. et al. Nanochemische Infrarotbildgebung von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten. Marmelade. Chem. Soc. 135, 18292–18295 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Amenabar, I. et al. Strukturanalyse und Kartierung einzelner Proteinkomplexe mittels Infrarot-Nanospektroskopie. Nat. Komm. 4, 2890 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

O'Callahan, BT, Hentschel, M., Raschke, MB, El-Khoury, PZ & Lea, AS Ultrasensitive spitzen- und antennenverstärkte Infrarot-Nanoskopie von Proteinkomplexen. J. Phys. Chem. C 123, 17505–17509 (2019).

Artikel Google Scholar

Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R. & Keilmann, F. Infrarotspektroskopische Kartierung einzelner Nanopartikel und Viren mit nanoskaliger Auflösung. Nano Lett. 6, 1307–1310 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paulite, M. et al. Abbildung der Sekundärstruktur einzelner Amyloidfibrillen eines β2-Mikroglobulinfragments mittels Nahfeld-Infrarotspektroskopie. Marmelade. Chem. Soc. 133, 7376–7383 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mészáros, LS et al. Spektroskopische Untersuchungen unter Ganzzellbedingungen liefern neue Einblicke in die Metallhydridchemie der [FeFe]-Hydrogenase. Chem. Wissenschaft. 11, 4608–4617 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Freitas, RO et al. Nano-Infrarot-Bildgebung primärer Neuronen. Zellen 10, 2559 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tranca, DE, Stanciu, SG, Hristu, R., Witgen, BM & Stanciu, GA Nanoskalige Kartierung des Brechungsindex mithilfe der optischen Nahfeld-Rastermikroskopie vom Streuungstyp. Nanomedizin 14, 47–50 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kanevche, K. et al. Infrarot-Nanoskopie und Tomographie intrazellulärer Strukturen. Komm. Biol. 4, 1341 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stanciu, SG, Tranca, DE, Hristu, R. & Stanciu, GA Korrelative Bildgebung biologischer Gewebe mit aperturloser optischer Nahfeldmikroskopie und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Biomed. Opt. Express 8, 5374–5383 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P. & Boccara, AC Infrarot-Reflexionsmodus-Nahfeldmikroskopie unter Verwendung einer aperturlosen Sonde mit einer Auflösung von λ/600. Opt. Lette. 21, 1315–1317 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Keilmann, F. Vibrations-Infrarot-Nahfeldmikroskopie. Vib. Spektroskopie 29, 109–114 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Taubner, T., Hillenbrand, R. & Keilmann, F. Nanoskalige Polymererkennung durch spektrale Signatur in der Streuinfrarot-Nahfeldmikroskopie. Appl. Physik. Lette. 85, 5064–5066 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Huth, F. et al. Nano-FTIR-Absorptionsspektroskopie molekularer Fingerabdrücke bei 20 nm räumlicher Auflösung. Nano Lett. 12, 3973–3978 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raschke, MB & Lienau, C. Aperturlose optische Nahfeldmikroskopie: Spitze-Proben-Kopplung bei elastischer Lichtstreuung. Appl. Physik. Lette. 83, 5089–5091 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Auner, HW & Cenci, S. Jüngste Fortschritte und zukünftige Richtungen bei der Bekämpfung des Sekretionsapparats beim multiplen Myelom. Br. J. Hämatol. 168, 14–25 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Gorin, J.-B. et al. Alpha-Partikel induzieren Autophagie in Zellen des multiplen Myeloms. Vorderseite. Med. 2, 74 (2015).

Artikel Google Scholar

Wang, Y. et al. Metformin induziert Autophagie und den Stillstand des Zellzyklus in der G0/G1-Phase beim Myelom, indem es auf die AMPK/mTORC1- und mTORC2-Signalwege abzielt. J. Exp. Klin. Krebs Res. 37, 63 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aizpurua, J. et al. Substratverstärkte Infrarot-Nahfeldspektroskopie. Opt. Express 16, 1529 (2008).

Artikel PubMed Google Scholar

Ocelic, N., Huber, A. & Hillenbrand, R. Pseudoheterodyne-Detektion für hintergrundfreie Nahfeldspektroskopie. Appl. Physik. Lette. 89, 101124 (2006).

Artikel Google Scholar

Ochs, R., Lischwe, M., Spohn, W. & Busch, H. Fibrillarin: ein neues Protein des Nukleolus, identifiziert durch Autoimmunseren. Biol. Zelle 54, 123–133 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Biggiogera, M. et al. Gleichzeitige immunelektronenmikroskopische Visualisierung der Protein B23- und C23-Verteilung im HeLa-Zellkern. J. Histochem. Zytochem. 37, 1371–1374 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ginisty, H., Amalric, F. & Bouvet, P. Nucleolin fungiert im ersten Schritt der ribosomalen RNA-Verarbeitung. EMBO J. 17, 1476–1486 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerace, L. & Burke, B. Funktionelle Organisation der Kernhülle. Annu. Rev. Cell Biol. 4, 335–374 (1988).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kornberg, RD Chromatinstruktur: eine sich wiederholende Einheit aus Histonen und DNA. Wissenschaft 184, 868–871 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McBride, HM, Neuspiel, M. & Wasiak, S. Mitochondrien: mehr als nur ein Kraftpaket. Curr. Biol. 16, R551–R560 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schwarz, DS & Blower, MD Das endoplasmatische Retikulum: Struktur, Funktion und Reaktion auf zelluläre Signale. Zelle. Mol. Lebenswissenschaft. 73, 79–94 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mastel, S. et al. Verständnis des Bildkontrasts von Materialgrenzen in der IR-Nanoskopie mit einer räumlichen Auflösung von 5 nm. ACS Photonics 5, 3372–3378 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Movasaghi, Z., Rehman, S. & ur Rehman, DI Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) von biologischen Geweben. Appl. Spektroskopie Rev. 43, 134–179 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Amrania, H. et al. Mittelinfrarot-Bildgebung in Brustkrebsgewebe: ein objektives Maß für die Einstufung von Brustkrebsbiopsien. Konverg. Wissenschaft. Physik. Oncol. 4, 025001 (2018).

Artikel Google Scholar

Dominici, M. et al. Angiogenese beim multiplen Myelom: Korrelation zwischen dem Wachstum endothelialer Kolonien in vitro (CFU-En) und klinisch-biologischen Merkmalen. Leukämie 15, 171–176 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Catovsky, D., Holt, PJ & Galton, DA Zweikernige Blastenzellen in Lymphozytenkulturen aus Myelomatose. Immunology 22, 1103–1109 (1972).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakai, Y., Ikeya, J., Morita, I. & Sato, K. Extramedulläres Plasmozytom der Tonsille, diagnostiziert durch Feinnadelaspirationszytologie. Ann. Diag. Pathol. 12, 41–43 (2008).

Artikel PubMed Google Scholar

Kumar, PV, Owji, SM, Talei, AR & Malekhusseini, SA Extramedulläres Plasmozytom. Befunde der Feinnadelpunktion. Acta Cytol. 41, 364–368 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Strouboulis, J. & Wolffe, AP Funktionelle Kompartimentierung des Zellkerns. J. Cell Sci. 109, 1991–2000 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lau, L., Lee, YL, Sahl, SJ, Stearns, T. & Moerner, WE STED-Mikroskopie mit optimierter Markierungsdichte zeigt die 9-fache Anordnung eines Zentriolproteins. Biophys. J. 102, 2926–2935 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amrania, H. et al. Neue IR-Bildgebungsmodalitäten zur Krebserkennung und zur chemischen Kartierung innerhalb der Zelle mit einem Subbeugungs-S-SNOM im mittleren IR. Faraday-Diskussion. 187, 539–553 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vicencio, JM et al. Die Kombinationstherapie mit Osimertinib und Anti-HER3 führt über die STING-Aktivierung in trans zu einer immunabhängigen Tumortoxizität. Zelltod-Dis. 13, 274 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kopek, BG et al. Verschiedene Protokolle für korrelative hochauflösende Fluoreszenzbildgebung und Elektronenmikroskopie chemisch fixierter Proben. Nat. Protokoll. 12, 916–946 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mateos, JM et al. Topografischer Kontrast ultradünner Kryoschnitte für korrelative hochauflösende Licht- und Elektronenmikroskopie. Wissenschaft. Rep. 6, 1–8 (2016).

Artikel Google Scholar

Thiam, HR, Wong, SL, Wagner, DD & Waterman, CM Zelluläre Mechanismen der NETose. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 36, 191–218 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Belhassen, J. et al. Auf dem Weg zur Verbesserung der spitzenverstärkten Nanoskopie mit optisch auflösenden Rastersondenspitzen. Adv. Photonik Nexus 2, 026002 (2023).

Artikel Google Scholar

Zenhausern, F., Martin, Y. & Wickramasinghe, HK Rasterinterferometrische aperturlose Mikroskopie: optische Bildgebung bei 10 Angström Auflösung. Science 269, 1083–1085 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zlei, M. et al. Charakterisierung des In-vitro-Wachstums von Zellen des multiplen Myeloms. Exp. Hämatol. 35, 1550–1561 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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CCP und GEG danken EPSRC für die finanzielle Unterstützung (EP/N509486/1, EP/R513052/1). HWA dankt Cancer Research UK (C41494/A29035) für die Unterstützung. CCP und DK bedanken sich für die Unterstützung von Cancer Research UK (C68186/A28503). Die Autoren danken Sandra Iles für die Herstellung des FFPE-Blocks, der zur Aufnahme des Fernfeld-Absorptionsspektrums von Zellen des multiplen Myeloms verwendet wird.

Experimentelle Festkörpergruppe, Fachbereich Physik, Imperial College London, London, Großbritannien

George E. Greaves, Darya Kiryushko und Chris C. Phillips

Department of Materials und London Centre for Nanotechnology, Imperial College London, London, Großbritannien

Darya Kiryushko und Alexandra E. Porter

Abteilung für Immunologie und Entzündung, The Hugh and Josseline Langmuir Centre for Myeloma Research, Imperial College London, London, Großbritannien

Holger W. Auner

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Das Projekt wurde von CCP und AEP konzipiert und koordiniert. Von HWA gespendete Myelomzellen wurden von DK in Schnitte präpariert. s-SNOM-Bilder wurden von GEG aufgenommen und analysiert. TEM-Bilder wurden von DK aufgenommen. Myeloma-FFPE-Blöcke wurden für die Verwendung in einem FTIR-Spektrometer vorbereitet und anschließend gemessen durch GEG Der Artikel wurde von GEG mit Beiträgen anderer Autoren verfasst. Alle Autoren haben das Papier gelesen und bestätigt.

Korrespondenz mit George E. Greaves oder Chris C. Phillips.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Le Wang, Stefan Stanciu und Xiaoji Xu für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Chao Zhou und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Greaves, GE, Kiryushko, D., Auner, HW et al. Markierungsfreie nanoskalige Kartierung der intrazellulären Organellenchemie. Commun Biol 6, 583 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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Eingegangen: 13. Januar 2023

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 31. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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