Ägyptischer Propolis-Extrakt zur Funktionalisierung von porösem Cellulose-Nanofaser/Poly(vinylalkohol)-Hydrogel sowie zur Charakterisierung und biologischen Anwendungen

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Jun 05, 2023

Ägyptischer Propolis-Extrakt zur Funktionalisierung von porösem Cellulose-Nanofaser/Poly(vinylalkohol)-Hydrogel sowie zur Charakterisierung und biologischen Anwendungen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7739 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bienenpropolis ist einer der häufigsten natürlichen Extrakte und hat aufgrund seines hohen Gehalts an Phenolsäuren und Flavonoiden, die für die antioxidative Wirkung natürlicher Produkte verantwortlich sind, großes Interesse in der Biomedizin geweckt. Die vorliegende Studie berichtet, dass der Propolis-Extrakt (PE) durch Ethanol in der Umgebung produziert wurde. Das erhaltene PE wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zu Cellulose-Nanofasern (CNF)/Poly(vinylalkohol) (PVA) gegeben und Gefrier-Auftau- und Gefriertrocknungsverfahren unterzogen, um poröse bioaktive Matrizen zu entwickeln. Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) zeigten, dass die vorbereiteten Proben eine miteinander verbundene poröse Struktur mit Porengrößen im Bereich von 10–100 μm aufwiesen. Die Ergebnisse der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) von PE zeigten etwa 18 Polyphenolverbindungen, mit den höchsten Mengen an Hesperetin (183,7 µg/ml), Chlorogensäure (96,9 µg/ml) und Kaffeesäure (90,2 µg/ml). Die Ergebnisse der antibakteriellen Aktivität zeigten, dass sowohl PE als auch PE-funktionalisierte Hydrogele eine potenzielle antimikrobielle Wirkung gegen Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans und Candida albicans zeigten. Die In-vitro-Testzellkulturexperimente zeigten, dass die Zellen auf den PE-funktionalisierten Hydrogelen die größte Lebensfähigkeit, Adhäsion und Ausbreitung der Zellen aufwiesen. Insgesamt unterstreichen diese Daten die interessante Wirkung der Propolis-Biofunktionalisierung zur Verbesserung der biologischen Eigenschaften von CNF/PVA-Hydrogel als funktionelle Matrix für biomedizinische Anwendungen.

Die häufigste Anwendung dreidimensionaler (3D) gewebeähnlicher biokompatibler Materialien besteht darin, die Geweberegeneration oder -heilung nach einer Schädigung zu steuern. Dies beruht auf der Fähigkeit dieser Materialien, die physiologische Mikroumgebung durch die Nutzung biochemischer, biophysikalischer Signale und manchmal mechanischer Stimulation zu optimieren, um die Zellfunktion zu verbessern1,2. Tatsächlich spielen bioaktive Materialien mehrere wichtige Rollen bei der Auslösung der Zellproliferation und -differenzierung sowie bei der Minimierung von Entzündungsreaktionen, die den Heilungsprozess verzögern können3,4. Hydrogele sind intelligente Biomaterialien, die zur Heilung einer Vielzahl von Geweben wie Haut, Knorpel, Knochen und Blutgefäßen eingesetzt werden können5. Sie können eine optimale (3D-)Struktur ähnlich der nativen extrazellulären Matrix (ECM) bereitstellen und die Diffusion von Gasen, Nährstoffen und Abfallstoffen durch die elastischen vernetzten Netzwerke ermöglichen6. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl von Polymermaterialien natürlichen oder synthetischen Ursprungs zur Entwicklung funktioneller Hydrogele verwendet. Faserverstärkte Hydrogele sind eine Klasse von Verbundhydrogelen, bei denen die Gelnetzwerke normalerweise mit Faserstrukturen verstärkt sind, um die mechanische Leistung zu verbessern und auch das Quellverhalten einzuschränken7,8,9.

Zellulose ist das am häufigsten vorkommende natürlich vorkommende Polymer auf der Erde und der Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwände und einiger tierischer Zellen10. Es handelt sich um ein lineares Homopolysaccharid, das aus β-D-Anhydroglucopyranose-Einheiten besteht, die durch β-(1→4)-Etherbindungen (glykosidische Bindungen) verbunden sind. Die gebildeten Celluloseketten werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zu Fibrillen verknüpft, die aus amorphen und kristallinen Bereichen bestehen. CNF bezeichnet eine spezifische Klasse von Nanocellulosen, die aus abwechselnd verbundenen amorphen und hochgeordneten Domänen bestehen und typischerweise durch den mechanischen Zerfall von Cellulosefibrillen erhalten werden11,12. Infolgedessen hat CNF Biomaterialien in Nanogröße hervorgebracht, die eine hohe Festigkeit, Oberfläche und einstellbare Oberflächenchemie aufweisen und kontrollierte Wechselwirkungen mit Polymeren, Nanopartikeln, kleinen Molekülen und biologischen Materialien ermöglichen. Beispielsweise wurde CNF in eine Alginat- und Polyvinylalkohollösung eingebettet, um ein stabiles Hydrogel zu bilden, das die In-situ-Mineralisierung von Calciumphosphaten fördert13. Außerdem wurde mit 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxyl (TEMPO) oxidiertes CNF, das Carboxylgruppen aufweist, durch Sojaproteinhydrolysat durch Amidierung von Carboxylgruppen gepfropft. Das aufgepfropfte CNF unterstützte die Hydroxylapatit-Mineralisierung aus doppelt simulierter Körperflüssigkeit, um ein neues bioaktives Material zu bilden14.

Eines der hydrophilen Polymere, die zur Herstellung biokompatibler synthetischer Hydrogele verwendet werden, ist PVA, ein teilkristallines Polymer. PVA-Hydrogel kann physikalisch vernetzt werden, um poröse biokompatible Materialien mit Mikrostruktur- und Verformungseigenschaften zu erzeugen, die mit biologischen Membranen vergleichbar sind, was sie ideal für biomedizinische Anwendungen macht15,16. Die physikalische Vernetzung von PVA kann durch wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen erfolgen. Bei dieser Methode wird die vorbereitete PVA-Lösung eingefroren, wodurch sich Eiskristalle bilden, die die PVA-Ketten wegdrücken und sie auf engstem Raum zusammenpacken. In diesen Regionen findet die Kristallisation des Polymers statt. Anschließend schmelzen die Eiskristalle durch den Auftauprozess und bilden poröse Kryogele mit Kristallen, die als Vernetzungsverbindungen dienen17. Obwohl herkömmliche Hydrogele hervorragende Eigenschaften wie Sicherheit, Biokompatibilität und höhere Hydrophilie besitzen, weisen sie eine begrenzte biologische Leistung auf. Heutzutage stellt die Kombination von Hydrogel mit therapeutischen Wirkstoffen (d. h. Medikamenten, natürlichen Extrakten, funktionellen Proteinen oder Genen) eine wirksame Methode dar, um günstigere Umgebungen für den Geweberegenerationsprozess zu schaffen und den schnellen Metabolismus therapeutischer Wirkstoffe zu vermeiden18.

Propolis ist ein natürliches Nebenprodukt der Bienenzucht, das seit der Antike zur Wundheilung eingesetzt wird. Propolis enthält mehr als 300 Verbindungen und die Farbe variiert je nach Vegetation der Region und der Pflanzenquelle. Abhängig von der regionalen Vegetation kann es gelbgrün oder dunkelbraun sein19. Propolis sichert nicht nur Risse in Bienenstöcken, sondern stärkt auch die Wabenzellen und schützt Bienenstöcke vor mikrobiellen Invasionen20. Die wichtigsten polyphenolischen Bestandteile von Propolis sind Flavonoide und Phenolsäureester, gefolgt von aromatischen Säuren, Lignanen und Terpenoiden21. Normalerweise besteht die Mischung zu 30 % aus Bienenwachs, zu 5 % aus Pollen und zu 50 % aus Harzen und pflanzlichen Balsamen21. Neben balsamischen, harzigen und gummiartigen Substanzen enthält Propolis auch Pollen, Speichel und Wachs und wird von Honigbienen aus den Ausscheidungen und Sprossen von Pflanzen gewonnen22.

Die antimikrobiellen Eigenschaften von Propolis werden Flavonoiden zugeschrieben, die gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam sind23. Viele biologische Eigenschaften werden mit Propolis in Verbindung gebracht, darunter antibakterielle, antimykotische, antivirale, entzündungshemmende, krebsbekämpfende und antitumorale Eigenschaften24,25. Materialien auf Propolisbasis werden als Wundheilmittel eingesetzt. Beispielsweise wird Propolis als Creme zur Förderung der Heilung des Hautgewebes verwendet und reduziert die Wundentzündung besser als Silbersulfadiazin26. Es fördert die Proliferation, Aktivierung und Wachstumskapazität der Hautzellen, ohne Toxizität oder allergische Reaktionen.

In jüngster Zeit haben funktionelle Hydrogele aufgrund ihrer Hydrophilie, Flexibilität und ihres inhärenten Adhäsionspotenzials an biologischen Geweben große Aufmerksamkeit für Anwendungen im Bereich Tissue Engineering und Regeneration auf sich gezogen. Diese besonderen Eigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Verlängerung der Verweilzeit eines bestimmten therapeutischen Inhaltsstoffs im direkten Kontakt mit seinem biologischen Ziel. Ziel der vorliegenden Studie ist daher die Herstellung eines 3D-Hydrogels aus PVA und CNF unter Verwendung wiederholter Gefrier- und Auftauzyklen als sicheres physikalisch vernetztes Hydrogel für eine wirksame Kombination von PE ohne unerwünschte Nebenwechselwirkungen mit Vernetzern, die an der chemischen Vernetzung beteiligt sind -verknüpfte Hydrogele. Die Mikrostrukturmerkmale PE-beladener Hydrogele wurden mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR), SEM und Röntgenbeugung (XRD) analysiert. Darüber hinaus wurden die Lebensfähigkeit der In-vitro-Testzellen und die Bindung an menschliche normale Fibroblastenzellen (HFB4) bestimmt. Abschließend wurden auch antibakterielle und entzündungshemmende Potenziale untersucht, wie in Abb. 1 zusammengefasst.

Schematische Darstellung der fünf Hauptschritte in der aktuellen Arbeit: (A) Propolis-Extrakt; (B) CNF-Präparat auf Basis gebleichter Bagasse; (C) CNF/PVA beladen mit PE; (D) Mikrostrukturcharakterisierung der erhaltenen Proben; und (D) biologische Anwendungen.

Die chemische Zusammensetzung von PE kann je nach Nahrungsquelle der Honigbiene variieren. Daher ist es wichtig, die chemische Zusammensetzung von PE zu veranschaulichen, um das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Verbindungen hervorzuheben. Wie in Tabelle 1 und Abb. 2 dargestellt, konnten mit der HPLC-Nachweismethode 18 Polyphenolverbindungen in PE identifiziert werden, die für dessen biologische Aktivität eine äußerst wichtige Rolle spielen. Die in PE dargestellten Polyphenolverbindungen mit dem höchsten Gehalt waren Hesperetin (183,73 µg/ml), Chlorogensäure (96,92 µg/ml), Kaffeesäure (90,28 µg/ml), Daidzein (67,89 µg/ml) und Apigenin (66,59 µg/ml). ). Während Rutin und Vanillin niedrige Konzentrationen von 0,8 bzw. 0,7 µg/ml aufwiesen. Andererseits ist das einzige Catechin, das im PE im Vergleich zum Standard nicht beobachtet wurde. Die geografische Herkunft und das Extraktionslösungsmittel von Propolis sind die Hauptfaktoren, die die Verfügbarkeit und Konzentration von Polyphenolverbindungen beeinflussen, wie in Tabelle 2 dargestellt.

HPLC-Fingerabdruck von PE.

Für die selektive Oxidation primärer Hydroxylgruppen in Cellulose (Abb. 3A) ist die TEMPO-vermittelte Oxidation eine geeignete Methode zur C-6-Oxidation zur Erzeugung reaktiver Carboxylgruppen. Abbildung 3B zeigt das FT-IR-Spektrum von CNF, das die charakteristischen Peaks für Celluloseketten aufweist35. Bei 1739 cm−1 wurde jedoch eine neue Bande beobachtet, die der Streckung der Carbonylgruppen (C=O) aus dem TEMPO-Oxidationsprozess zugeschrieben wurde. Der vorbereitete CNF wurde durch das in Abb. 3C dargestellte XRD-Muster bestätigt. Es zeigt zwei Hauptbeugungspeaks bei 16,4° (110) und 23,1° (200), die charakteristisch für native Cellulose sind. Auch der Kristallinitätsprozentsatz wurde nach der Segal-Methode geschätzt und betrug etwa 73 %36. Die innere Struktur von CNF wurde auch mittels Transmissionselektronenmikroskop-Analyse (TEM) untersucht. Abbildung 3D zeigt CNF mit einer mikrometrischen Länge und einem Durchmesser zwischen 4 und 20 nm, berechnet durch Bildanalyse. Darüber hinaus zeigten die Nanofasern aufgrund der homogenen Bildung von Carboxylatgruppen auf der Oberfläche der Fasern eine einheitliche Struktur.

Chemische Analyse von Zellulosematerialien (A) FT-IR von Zellulose, (B) FT-IR von CNF, (C) XRD von CNF und (D) TEM-Bild von CNF.

Tatsächlich werden Polymerhydrogele durch physikalische oder chemische Vernetzung oder sogar beides hergestellt. Physikalisch vernetzte Hydrogele entstehen durch schwache Wechselwirkungen, während bei der chemischen Vernetzung von Hydrogelen eine chemische kovalente Bindung entsteht. Unter diesen können PVA-Hydrogele einfach durch die Gefrier-Tau-Technik gebildet werden. In dieser Studie wurden PE-beladene Hydrogele auf Basis von CNF und PVA durch einfache physikalische Vernetzung nach aufeinanderfolgenden Einfrier- und Auftauvorgängen und anschließender Gefriertrocknung hergestellt, um poröse 3D-Strukturen zu erzeugen. Abbildung 4A–C zeigt REM-Bilder der Oberflächen der faserverstärkten CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-Hydrogele sowie die Querschnittsbilder derselben Hydrogelprobe. Abbildung 4D zeigt die Querschnittsbilder für dieselben Hydrogele. Bilder von Querschnitt und Oberfläche bestätigen die Bildung grober, miteinander verbundener poröser 3D-Strukturen mit unregelmäßigen Poren, deren Größe zwischen 10 und 100 µm variiert. Diese mikroporöse Struktur ist für die Zellrekrutierung sehr wichtig, da sie den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen erleichtert. Die Einführung von PE in das Hydrogel führt zu einer Verringerung der Porengröße und der Oberflächenrauheit. Diese Verringerung der Porengröße lässt auf das Vorhandensein von PE auf der Oberfläche des Hydrogels schließen, was dessen schnelle Freisetzung bei der Implantation in vivo fördert. Diese schnelle Freisetzung antibakterieller Wirkstoffe wie PE ist wichtig, um die Bakterieninvasion zu stoppen.

REM-Bilder von faserverstärkten Hydrogelen bei unterschiedlichen Vergrößerungen (×200, bei ×500 und ×1000) und zugehörige Querschnittsbilder derselben Probe (×200). (A) CNF/PVA, (B) CNF/PVA/PE1 und (C) CNF/PVA/PE2.

Abbildung 5 zeigt die FT-IR-Spektren von PE- und PE-beladenen PVA/CNF-Hydrogelproben. Das IR-Spektrum der PE-Probe, Abb. 5A, zeigt eine breite Bande mit der Mitte bei 3410 cm−1, die typischerweise der O-H-Streckschwingung der Phenolverbindungen zugeschrieben wird37. Die beiden Banden bei 2920 und 2840 cm−1 hängen mit der asymmetrischen bzw. symmetrischen C-H-Streckung von Kohlenwasserstoffverbindungen zusammen38. Während die Banden bei 1720 und 1460 cm−1 der Carbonyl-C=O-Streckschwingung des Flavonoid- und Lipidgehalts zugeordnet werden. Darüber hinaus sind die Banden bei 1370 und 1271 cm−1 auf Scherenschwingungen von C-H-Gruppen bzw. C-O-H-Streckschwingungen zurückzuführen39. Schließlich hängen die Banden bei 1165, 1040 und 870 cm-1 mit der Streckschwingung der C=C-Bindung von Alkenen, der C-O-C-Bindung aromatischer Ether und der C-H-Schwingungsschwingung von Phenolverbindungen zusammen40.

FT-IR-Spektren von (A) PE, (B) CNF/PVA, (C) CNF/PVA/PE1 und (D) CNF/PVA/PE2 faserverstärkten Hydrogelen.

Andererseits zeigt das FT-IR-Spektrum von CNF/PVA-Hydrogel eine breite Bande bei 3294 cm−1, die auf die O-H-Streckschwingung der Hydroxylgruppe von PVA und CNF zurückzuführen ist, wie in Abb. 5B dargestellt . Die Banden bei 2905, 1708 und 1420 cm−1 gehören zur C-H-Streckschwingung, zur C=O-Streckschwingung bzw. zur CH2-Biegeschwingung. Die anderen Banden bei 1040 und 870 cm−1 stehen im Zusammenhang mit den CO- und CH2-Streckschwingungen41. Die FT-IR-Spektren von CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen sind in Abb. 5C bzw. D dargestellt. Die Spektren beider Proben zeigen mit einigen Modifikationen Peaks im Zusammenhang mit CNF/PVA-Hydrogel. Beispielsweise wurden die O-H-Streckschwingungsbanden für die CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-Proben auf 3335 bzw. 3351 cm−1 verschoben. Darüber hinaus wurden die C=O-Streckschwingungsbanden bei 1739 cm−1 für die CNF/PVA/PE1-Probe und bei 1725 cm−1 für die CNF/PVA/PE2-Probe beobachtet. Zusammen können diese Verschiebungen auf die Wechselwirkung zwischen der CNF/PVA-Polymermatrix und Propolis zurückgeführt werden41.

Die Tendenz zur Wasseraufnahme oder das Quellverhalten von CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen ist in Abb. 6 dargestellt. Die Wasseraufnahmeverhältnisse sind bei allen Proben hoch und nehmen mit der Zeit allmählich zu . Dies kann auf die hochporöse Struktur der Proben zurückzuführen sein, die eine einfache Diffusion von Wasser durch das Hydrogel ermöglicht. Wie in Abb. 6 dargestellt, weisen die mit PE beladenen Proben (CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2) geringere Wasseraufnahmeverhältnisse auf als die reinen Proben (CNF/PVA). Beispielsweise beträgt das Verhältnis der Wasseraufnahme für CNF/PVA in einem Zeitintervall von 12 Stunden etwa 907 %, während es für CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2 648 % bzw. 590 % beträgt. Daher verringert das Vorhandensein von PE in den faserverstärkten Hydrogelen CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2 deren Fähigkeit zur Wasseraufnahme, was auf die hydrophobe Natur von PE und die Abnahme der Porengröße zurückzuführen sein kann, wie aus SEM-Beobachtungen hervorgeht ( Abb. 4)40.

Wassergehaltsverhältnis (%) der Proben CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2 in verschiedenen Zeitintervallen.

Propolis ist ein harziges Material, das aus den Knospen und Blüten von Pflanzen gewonnen wird und als Schutzmittel gegen mikrobielle Kontamination verwendet wird42. Polyphenole sind die wichtigsten chemischen Bestandteile von PE und für seine antimikrobielle Aktivität verantwortlich43. Die antimikrobielle Wirkung von PE und CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen wurde mit verschiedenen Ansätzen auf Krankheitserreger für den Menschen untersucht. Die antimikrobielle Aktivität von PE ist in Tabelle 3 und Abb. 7 dargestellt. Obwohl PE ein antimikrobielles Potenzial gegen alle untersuchten Mikroorganismen aufwies, hat es keinen Einfluss auf S. typhimurium, wie von Atik et al.44 berichtet. Das Kontroll-CNF/PVA-Hydrogel hat keine Wirkung gegen die untersuchten Mikroorganismen. Die Ergebnisse zeigen eine deutlich höhere antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive (S. mutans), ohne signifikanten Unterschied zwischen Gram-negativen (E. coli) und C. albicans. Darüber hinaus wurde die MHK auch durch die Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Die MHK von PE für E. coli betrug 0,012 mg/ml, 0,05 mg/ml für S. mutans und 0,025 mg/ml für C. albicans. Andererseits zeigen die mit CNF/PVA-Fasern verstärkten Hydrogele mit PE in unterschiedlichen Konzentrationen eine antimikrobielle Wirkung gegen die verwendeten Stämme, wobei die höchste antimikrobielle Aktivität bei S. typhimurium beobachtet wurde, gefolgt von S. mutans und anderen Mikroben, die keine signifikanten Unterschiede zeigten . Der Unterschied im antimikrobiellen Verhalten des PE könnte auf die unterschiedlichen Zellwände zwischen den grampositiven und negativen Bakterien zurückzuführen sein45. Die Aktivität von PE als antimikrobielle Wirkstoffe hängt mit dem hohen Anteil an Hesperetin (183,7 µg/ml), Chlorogensäure (96,9 µg/ml) und Kaffeesäure (90,2 µg/ml) als Hauptpolyphenolverbindungen von PE zusammen. Wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden Hesperetin, Chlorogensäure und Kaffeesäure als drei Verbindungen aus PE mit hohen Konzentrationen angegeben. Hesperetin wurde durch enzymatische Hydrolyse von Hesperidin gewonnen und auf antimikrobielle Aktivität gegen grampositive und gramnegative Bakterien untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Hesperetin die Modellmikroben wirksamer hemmte als Hesperidin und Hesperidinglucosid 46. Yen et al.47. fanden heraus, dass Chlorogensäure einer der Hauptbestandteile des Wasserextrakts von grünen Kaffeebohnen unter hohem Druck war und antibakterielle Aktivität sowohl gegen Gram-positive (Staphylococcus aureus und Listeria innocua) als auch gegen Gram-negative (Escherichia coli und Salmonella enterica) zeigte. Kaffeesäure und ihre Kombination mit antibiotischen Phytochemikalien wurden gegen Staphylococcus aureus untersucht, und die Ergebnisse zeigten unterschiedliche Wirkungen gegen Staphylococcus aureus, wobei die MHK zwischen 256 und 1024 µg/ml variierte48. Die meisten der getesteten Polyphenolverbindungen waren nicht wirksam gegen die verwendeten Modellmikroben, wenn sie als einzelne Verbindung getestet wurden, aber in Kombination mit anderen Verbindungen erhöhte sich die Aktivität der antimikrobiellen Mittel. Laut Ahmed et al.49 war Gallussäure in einer Konzentration von 200 und 400 µg/ml gegen S. aureus und S. pyogenes wirksam, nicht jedoch gegen gramnegative Bakterien. Andererseits wurde das aus dem Abwasser der Olivenmühle extrahierte Antilösungsmittel in Kombination mit Gallussäure mit niedrigen minimalen Hemmkonzentrationen getestet, wobei sich herausstellte, dass 50/100–100/100 µg/ml eine vollständige Wachstumshemmung aller verwendeten Bakterien verursachten synergistische Wirkungen phenolischer Verbindungen gegenüber den verwendeten Modellbakterien. Andere Studien berichten, dass aus Traubentrester extrahierte Polyphenolverbindungen in Kombination mit Vertretern verschiedener Antibiotikaklassen wie β-Lactam, Chinolon, Fluorchinolon, Tetracyclin und Amphenicol bei allen getesteten S. aureus- und E. coli-Stämmen mit fraktionierter Hemmkonzentration synergetisch wirken Indexwerte (FICI) variieren zwischen 0,031 und 0,155. Die MHK wurde aufgrund der synergistischen Wirkung von Phenolverbindungen mit verschiedenen Antibiotika um das 4- bis 75-fache reduziert50. Frühere Studien förderten die Verbundmembran aus Propolis, um ihre biologischen Bewertungen zu verbessern, zum Beispiel Polymilchsäure/ätherisches Öl51, Poly-ε-Caprolacton52, bakterielle Zellulose/ZnO-NPs53, Chitosan/Ag-NPs54 und Polyurethan/Nanolignin55. In Tabelle 4 können wir die wichtigsten bioaktiven Polyphenolverbindungen aus PE mit antimikrobieller Aktivität zusammenfassen.

Antimikrobielle Aktivität, ausgedrückt als Halo-Zonen des PE in verschiedenen Konzentrationen durch die Agar-Well-Diffusionsmethode (A) und CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkte Hydrogele durch die Scheibendiffusionsmethode (B) gegen vier Krankheitserreger Mikroben.

HFB4-Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in Medium mit PE inkubiert, um eine vollständige Monoschichtschicht zu entwickeln. Es wurden unterschiedliche PE-Konzentrationen bis zu Konzentrationen von 1000 µg/ml eingesetzt. Wir beobachteten, dass PE bei Konzentrationen über 125 µg/ml die Lebensfähigkeit der Zellen laut MTT deutlich reduzierte (Abb. 8). Konzentrationen bis zu 125 µg/ml hatten keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Darüber hinaus wurde Lichtmikroskopie verwendet, um die Zellproliferation nach Behandlung von HFB4-Zellen mit unterschiedlichen PE-Dosen zu bestätigen. Im Vergleich zur Kontrolle war eine Abnahme der Zellzahl bei steigender PE-Konzentration deutlich zu erkennen (Abb. 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PE-Konzentrationen über dem Grenzwert von 125 µg/ml schädliche Auswirkungen auf HFB4-Zellen haben können. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Ergänzung mit natürlichen Extrakten die Produktion reaktiver Spezies und den oxidativen Stress in vitro und in vivo-Tests erhöhen kann, was zu oxidativen Schäden und Zelltod führt73,74.

Lebensfähigkeit von HFB4-Zellen, die 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen (31,25–1000 μg/ml) PE behandelt wurden. Die Daten wurden als mittlerer Prozentsatz der Formazanbildung in unbehandelten Zellen (Kontrolle) ausgedrückt. Die Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten erhalten (sechs Wiederholungen für jedes Experiment). (*) bedeutet p weniger als 0,05 und **p mehr als 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

Abbildung 9 zeigt die Lebensfähigkeit von HFB4-Zellen, wie durch den MTT-Assay bestimmt, wenn sie mit verschiedenen Hydrogelproben behandelt werden. Die Lebensfähigkeit von Zellen, die mit PE-haltigen Proben (CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2) behandelt wurden, ist höher als die von CNF/PVA-Proben ohne PE. Dies spiegelt wider, dass die Anwesenheit von PE die Lebensfähigkeit von HFB4-Zellen erhöht.

(A) Lebensfähigkeit der Zellen mittels MTT-Assay, während (B–D) REM-Aufnahmen von HFB4-Zellen nach 24-stündiger Aussaat auf faserverstärkten CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-Hydrogelen. (*) bedeutet p weniger als 0,05 und **p mehr als 0,05 im Vergleich zur Kontrolle.

REM-Bilder der Ausbreitung und Adhäsion von HFB4-Zellen, die mit CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen behandelt wurden, sind in Abb. 9 dargestellt. Wie zu sehen ist, haben alle ausgesäten Zellen eine abgerundete Form kann durch die Dehydrierung während des Fixierungsprozesses verursacht werden. Die Ausbreitung von Zellen auf mit Propolis beladenen Proben (CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2) ist höher als bei einer Kontrollprobe ohne PE (CNF/PVA). Außerdem ist die Ausbreitung und Anlagerung von Zellen in der Probe mit einem höheren PE-Gehalt (CNF/PVA/PE2) größer als in der Probe mit einem niedrigeren PE-Gehalt (CNF/PVA/PE1). Daher fördert die Anwesenheit von Propolis das Zellwachstum und die Zelladhäsion. Insgesamt veranschaulichen die in dieser Arbeit durchgeführten In-vitro-Tests die Bedeutung des vorbereiteten Propolis-verstärkten Hydrogels als zytokompatibles Material, das die Zelladhäsion und -ausbreitung in einer 3D-Umgebung fördert.

Die Stabilisierung von Erythrozytenmembranen ist ein etablierter Test zur Untersuchung der entzündungshemmenden Wirkung implantierter Biomaterialien. Eine Entzündung entsteht durch die Freisetzung verschiedener Enzyme aus zersetzten lysosomalen Vesikeln75. Daher verhindert die Stabilisierung der Erythrozytenmembran das Austreten dieser Enzyme und das Auftreten von Entzündungen75. Der Hämolysetest ist ein sehr wichtiger Test, insbesondere für Materialien, die mit Blut in Kontakt kommen. Tabelle 5 erläutert die Ergebnisse der Hämolysehemmung für PE, Proben von CNF/PVA-Hydrogel und solche, die mit Propolis beladen sind (CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2). Das Indomethacin-Medikament wurde als Verleumdungsmedikament (Positivkontrolle) verwendet und bietet bei einer Konzentration von 200 µg/ml den höchsten Schutz (100 ± 2,362 %) gegen die durch Hypotonie verursachte Lyse von Erythrozyten. Wie in Tabelle 2 gezeigt, schützen alle Proben menschliche Erythrozyten in konzentrationsabhängiger Weise. Die Schutzwirkung der CNF/PVA/PE2-Probe und PE ist bei unterschiedlichen Konzentrationen nahezu gleich. Die geringste Schutzwirkung wird für die CNF/PVA-Probe (ohne PE) verzeichnet. Aus diesen Erkenntnissen geht klar hervor, dass die PE-beladenen Hydrogele als entzündungshemmende Mittel vielversprechend sind.

Propolis ist ein natürliches Nebenprodukt mit hohem Wert für vielfältige biologische Anwendungen. Die HPLC-Analysen von PE ergaben etwa 18 Polyphenolverbindungen, wobei Hesperetin die höchste Konzentration darstellte, gefolgt von Chlorogensäure und Kaffeesäure. CNF wurde durch Oxidations-Defibrillation von aus gebleichter Zuckerrohrbagasse gewonnener Cellulose hergestellt und zur Herstellung von nachhaltigem und porösem CNF/PVA verwendet, das mit verschiedenen PE-Konzentrationen beladen war. Die vorbereiteten Gerüste wiesen eine hochporöse Struktur mit Porengrößen von bis zu 100 µm auf. Die erhaltenen PE-beladenen CNF/PVA-Hydrogele weisen eine hoch antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, S. mutans-Bakterien und dann C. albicans auf. Die zellulären Reaktionen zeigten auch, dass die Zellen auf den PE-funktionalisierten CNF/PVA-Hydrogelen eine optimale Mikroumgebung für die Anlagerung und Proliferation von HFB4-Zellen aufwiesen. Bemerkenswerterweise deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die PE-Funktionalisierung von CNF/PVA nicht nur die antimikrobiellen Eigenschaften PE-beladener CNF/PVA-Hydrogele verbessert, sondern auch zu einem erheblichen entzündungshemmenden Potenzial führt. Daher werden In-vivo-Experimente vor der klinischen Anwendung dringend empfohlen, um die Wirksamkeit PE-beladener CNF/PVA-Hydrogele bei der Wundheilung zu unterstreichen.

Gebleichter Bagasse-Zellstoff wurde von der Qena Company of Paper Industry, Ägypten, bezogen. TEMPO wurde von Merck bezogen. Natriumbromid wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Das in dieser Arbeit verwendete Propolis-Rohmaterial wurde im Juli 2022 von einem örtlichen Imker (Mansoura, Dakahlia, Ägypten) gesammelt. Polyvinylalkohol – PVA (MW85.000–124.000 g/mol, 99,1 % hydrolysiert) wurde von Sigma-Aldrich gekauft. Bei dieser Untersuchung wurden auch Natriumhydroxid, destilliertes Wasser und Ethanol eingesetzt.

PE wurde gemäß Bozkuş et al.31 mit geringfügigen Modifikationen gesammelt. Kurz gesagt, etwa 10 g Rohmaterial wurden in 100 ml 70 %igem Ethanol gelöst und dann 14 Tage lang an einem dunklen Ort bei 37 °C in einen Inkubator gestellt. Nach der Filtration mit Whatman-Filterpapier (Nr. 1) wurde die Mischung 15 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert und dann 5 Tage lang bei 40 °C im Ofen getrocknet, bis das Gewicht konstant blieb. Das erhaltene PE wurde bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Polyphenolverbindungen (Phenole und Flavonoide) von PE wurden nach Kong et al. mit geringfügigen Modifikationen durch HPLC (Agilent 1260-Serie, USA) analysiert76. Chromatografische Bedingungen: Die chromatographische Trennung wurde auf einer Eclips C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5,0 µm) durchgeführt. Die mobile Phase umfasste (A) Wasser und (B) 0,05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril bei einer Flussrate von 1 ml/min. Der Lösungsmittelgradient war: 0 Min. 82 % A, 0–5 Min. 80 % A, 5–8 Min. 60 % A, 8–12 Min. 60 % A, 12–15 Min. 82 % A, 15–16 Min. 82 % A und 16–20 Minuten 82 % A. Der Multiwellenlängendetektor wurde bei 280 nm überwacht. Das Injektionsvolumen betrug für jede Probenlösung 5 µl. Die Säulentemperatur wurde bei 40 °C gehalten.

Für die Herstellung von TEMPO-oxidiertem CNF wurde gebleichte Bagasse nach der von Salama et al.35 beschriebenen Methode verwendet. Kurz gesagt, 20 g gebleichter Bagasse-Zellstoff wurden in destilliertem Wasser mit TEMPO (0,8 g) und Natriumbromid (8 g) dispergiert. Anschließend wurden kontinuierlich 300 ml Natriumhypochloritlösung (15 %) zugegeben und der pH-Wert mit NaOH-Lösung (3 mol/L) auf 10 eingestellt. Am Ende der Reaktion wurde der pH-Wert auf 7,0 gesenkt und das Produkt mehrmals bei 10.000 U/min zentrifugiert. Zur Reinigung des Produkts wurde eine Dialyse mit entionisiertem Wasser durchgeführt.

Das poröse CNF/PVA-Hydrogel wurde unter Verwendung der Gefrier-Auftau- und Gefriertrocknungsmethoden nach Müller et al.77 hergestellt. Das Polymergewichtsverhältnis wurde auf 50:50 (CNF:PVA) eingestellt. Kurz gesagt, 30 ml PVA-Lösung mit einer Konzentration von 10 Gew.-% wurden in destilliertem Wasser unter Verwendung eines Magnetrührers bei 95 °C hergestellt. Nach 4 Stunden wurden 100 ml CNF-Lösung (3 Gew.-%) zur PVA-Lösung gegeben und 10 Minuten lang bei 5000 U/min mechanisch gerührt. Dann wurde die CNF/PVA-Mischung in eine 10 cm große runde Form gegossen und 3 Stunden lang bei –40 °C eingefroren, gefolgt von 3 Stunden Auftauen bei Raumtemperatur, um eine PVA-Vernetzung zu ermöglichen. Die erhaltenen Hydrogele wurden vier Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen und anschließend bei –80 °C gefriergetrocknet. Um PE-beladene CNF/PVA-Hydrogele herzustellen, wurden unterschiedliche Anteile des PE (0,1 und 0,2 g) in 2 ml Ethanol gelöst und dann zu 22 ml der CNF/PVA-Suspensionslösungsmischung gegeben. Die Mischungen wurden 1 Stunde lang auf einem Magnetrührer bei 40 °C gehalten, um eine vollständige Auflösung von PE sicherzustellen. Die Lösungen wurden durch mechanisches Rühren 10 Minuten lang bei 5000 U/min homogenisiert, bevor sie in eine runde Form gegossen, einem Gefrier-Auftau-Zyklus unterzogen und schließlich wie oben erwähnt bei –80 °C lyophilisiert wurden. Die vorbereiteten Proben wurden als CNF/PVA für die Kontrolle (ohne PE), CNF/PVA/PE1 für die Probe mit 0,1 g PE und CNF/PVA/PE2 für die Probe mit 0,2 g PE bezeichnet.

Die Morphologie des hergestellten CNF/PVA-Hydrogels, das mit unterschiedlichen PE-Konzentrationen verstärkt war, wurde mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) (JSM 6360LV, JEOL/Noran) untersucht. Die Schätzung der Porengröße wurde aus verschiedenen REM-Bildern unter Verwendung des Winkeltools von ImageJ mit Java 1.8.0-Software (National Institute of Health (NIH), USA)78 ermittelt. Mit dem FT-IR (Modell FT/IR-6100 Typ A) wurden die chemischen Funktionsgruppen der Proben untersucht. Die Spektren wurden bei Wellenzahlen im Bereich von 400–4000 cm−1 aufgenommen. Das XRD-Muster wurde mit einem Empyrean-Pulverdiffraktometer (Cu Kα, 0,154 nm) zwischen 5 und 70° 2θ mit einer Schrittweite von 0,01°/s aufgezeichnet, um die im vorbereiteten CNF gebildete Phase zu untersuchen. Zur Untersuchung der inneren Struktur von CNF wurde ein ultrahochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop (JEOL-2010) eingesetzt.

Die Bewertung des vorbereiteten Hydrogels hinsichtlich der Wasseraufnahme erfolgte mit geringfügigen Änderungen nach Eskandarinia et al.79. Vorbereitete faserverstärkte Hydrogele (CNF/PVA, CNF/PVA/PE1 und CNF/PVA/PE2) wurden in 1 cm × 1 cm große Stücke geschnitten, genau gewogen (Wi) und in verschlossenen Fläschchen bei 37 °C in 10 ml destilliertes Wasser getaucht °C. In festgelegten Zeitintervallen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 12 Stunden) wurden Proben aus den Fläschchen entnommen, mit einem Seidenpapier abgetupft, um das Oberflächenwasser zu entfernen, und gewogen (Ww). Das Wasseraufnahmeverhältnis (Quellverhältnis) der Proben wird nach folgender Gleichung angegeben:

Die antimikrobielle Aktivität der faserverstärkten PE-, CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-Hydrogele wurde gegen vier ausgewählte Krankheitserreger bewertet, darunter gramnegative Bakterien [Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli) und Salmonella typhimurium ATCC 14028 (S. typhimurium)], grampositive Bakterien [Streptococcus mutans ATCC 25175 (S. mutans)] und Hefe [Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans)]. Alle Mikroben wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bereitgestellt. Die Mikrobenstämme wurden in einem Reagenzglas mit 5 ml Mueller-Hinton-Brühe, bestehend aus (%): 0,2 Rindfleischextrakt, 1,75 Säurehydrolysat von Casein und 0,15 Stärke, unter Startkultivierung (200 U/min) 1 Tag lang bei 37 °C kultiviert . Die antimikrobielle Aktivität der Propolis- und verschiedener Hydrogelproben wurde durch den Agar-Well- bzw. Scheibendiffusionsansatz durchgeführt.

Die antimikrobielle Wirkung des PE wurde mit der Agar-Well-Diffusionstechnik nach Roy und Rhim80 mit geringen Modifikationen qualitativ bewertet. Kurz darauf wurde die mikrobielle Suspension (108 KBE/ml) mit ungefähr gleicher Konzentration oder Dichte wie 0,5 McFarland-Standards auf der Oberfläche der Petrischale verteilt, die Mueller-Hinton-Agarmedium (2 %) enthielt. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration des PE, die eine geringe Hemmzone gegen das mikrobielle Ziel aufweist. Zur MHK-Bestimmung wurde Propolis in verschiedenen Konzentrationen von 0,1, 0,05, 0,025, 0,012 und 0,006 mg/ml (beschriftet mit 1, 2, 3, 4 bzw. 5) in die Medienvertiefungen (4 mm Durchmesser) gegraben. mit einem sterilen Glasbohrer aufgenommen und mit 65 μl getestetem Propolis beladen. Die Negativkontrolle wurde durch Beladen der mittleren Vertiefungen mit DMSO durchgeführt.

Die antimikrobielle Aktivität der hergestellten faserverstärkten CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-Hydrogele wurde mit geringfügigen Modifikationen durch den Scheibendiffusionsansatz nach Yahia et al.81 erzielt. Kurz gesagt, 100 µL seriell verdünnter Krankheitserreger wurden separat auf den Petrischalen des Mueller-Hinton-Agarmediums zusammen mit Scheiben (5 mm Durchmesser) der Verbundmembranen, die mit unterschiedlichen Propoliskonzentrationen beladen waren, verteilt. Als Kontrolle wurde das faserverstärkte Hydrogel ohne Propolis verwendet.

Alle Platten wurden 120 Minuten lang bei 4 °C belassen. Um die Diffusion der getesteten Probe zu vervollständigen und die Modellmikroben zu hemmen, wurde sie anschließend 1 Tag lang bei 37 °C inkubiert, wobei die antibakterielle Aktivität durch Messung des Durchmessers der entwickelten Hemmzone (einschließlich der Vertiefung oder Membranscheibe) nach der Messung beurteilt wurde Inkubationszeitraum. Um die aseptischen Bedingungen sicherzustellen, wurden alle Membranen vor der Anwendung 30 Minuten lang unter UV-Licht sterilisiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Durchschnittsergebnisse wurden dargestellt.

Der Zytotoxizitätstest von CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen sowie PE gegen HFB4-Zellen wurde unter Verwendung von MTT (3-4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 durchgeführt -Diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) Assay82,83. Die vorbereiteten Hydrogele wurden dreimal mit Medium gespült und dann auf den Boden einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen ausplattiert. Die 24-Well-Platte wurde mit 1 × 105 Zellen/ml (1000 µL/Well) beimpft und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um eine vollständige Monoschichtschicht zu entwickeln. Die Zellen wurden auf Blattbildung und zytotoxische Wirkungen untersucht. Die HFB4-Zellen wurden auf physikalische Anzeichen von Toxizität überprüft, z. B. vollständiger oder teilweiser Verlust der Monoschicht, Rundung, Schrumpfung oder Zellgranulation. Es wurde eine MTT-Lösung hergestellt (5 mg/ml in PBS) (BioBasic Canada Inc). In jede Vertiefung wurden 100 µL MTT-Lösung gegeben. Stellen Sie es 5 Minuten lang auf einen Schütteltisch mit 150 U/min, um das MTT gründlich mit dem Medium zu vermischen. Inkubieren (37 °C, 5 % CO2) für 4 Stunden, damit das MTT metabolisiert werden kann. Anschließend wurden 200 μl DMSO mit den Kulturzellen vermischt, um die Formazankristalle zu solubilisieren, die durch die Reduktion von MTT in lebenden Zellen erhalten wurden. Anschließend wurde die mittlere Absorption jeder Vertiefung bei 570 nm mit einem Spektrophotometer berechnet. Es wurden drei parallele Experimente durchgeführt. Die Absorption sollte direkt mit der Zellzahl korrelieren82,83. Für PE wurde die 24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 × 105 Zellen/ml (100 µL/Well) beimpft und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um eine vollständige Monoschichtschicht zu entwickeln. Das Wachstumsmedium wurde von Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen dekantiert, nachdem sich eine konfluente Zellschicht gebildet hatte. Anschließend wurde die Zellmonoschicht zweimal mit Waschmedium gewaschen. Eine zweifache Verdünnung der getesteten Probe wurde in RPMI-Medium mit 2 % Serum (Erhaltungsmedium) hergestellt. 0,1 ml jeder Verdünnung wurden in verschiedenen Vertiefungen getestet, wobei drei Vertiefungen als Kontrollen übrig blieben und nur Erhaltungsmedium erhielten. Dann wurden die gleichen Schritte wie oben erwähnt durchgeführt.

HFB4-Zellen wurden in 24-Well-Platten gezüchtet, die CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkte Hydrogele enthielten84. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit 5 % (V/V) Glutaraldehyd fixiert und dann schrittweise mit seriellen Ethanollösungen (70–100 % für jeweils 20 Minuten) dehydriert. Anschließend wurden die Proben für SEM-Beobachtungen mit Gold besputtert.

Die Herstellung der Erythrozytensuspension erfolgte nach Anosike et al.75. Kurz gesagt, etwa 3 ml frisches Vollblut von gesunden Freiwilligen wurden in heparinisierte Röhrchen gegeben und dann 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Zum Auflösen der roten Blutkügelchen wurde ein Volumen normaler Kochsalzlösung verwendet, das dem des Überstands entsprach. Das Volumen der erhaltenen gelösten roten Blutpellets wurde gemessen und als 40 % v/v Suspension mit einer isotonischen Pufferlösung (10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) zurückgegeben. Die Pufferlösung wurde aus 0,2 g NaH2PO4, 1,15 g Na2HPO4 und 9 g NaCl in 1 l destilliertem Wasser gebildet. Die zurückgegebenen roten Blutkörperchen (resuspendierter Überstand) wurden als solche verwendet.

Gleiche Gewichte von CNF/PVA-, CNF/PVA/PE1- und CNF/PVA/PE2-faserverstärkten Hydrogelen wurden sorgfältig gemahlen und in destilliertem Wasser (hypotonische Lösung) suspendiert. 5 ml der hypotonischen Lösung mit abgestuften Dosen der Proben (100, 200, 400, 600, 800 und 1000 µg/ml) wurden in Duplikatpaare (pro Dosis) der Zentrifugenröhrchen gegeben. 5 ml isotonische Lösung abgestufter Probendosen (100–1000 µg/ml) wurden ebenfalls in Duplikatpaare (pro Dosis) der Zentrifugenröhrchen gegeben. Die gleichen vorherigen Schritte wurden für PE-Harz durchgeführt, jedoch ohne Schleifen. Als Kontrollröhrchen wurden ein Röhrchen mit 5 ml des Vehikels (destilliertes Wasser) und ein weiteres Röhrchen mit 5 ml 200 µg/ml Indomethacin verwendet. In jedes Röhrchen wurde eine Suspension (0,1 ml) Erythrozyten gegeben und vorsichtig gemischt. Die Gemische wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (37 °C) inkubiert und anschließend 3 Minuten lang bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Absorption (Ab) von Hämoglobin im Überstand wurde unter Verwendung eines Spectronic-Spektrophotometers (Milton Roy) auf 540 nm geschätzt. Zur Berechnung des Hämolyseprozentsatzes wurde angenommen, dass die in Gegenwart von destilliertem Wasser gebildete Hämolyse 100 % beträgt. Die prozentuale Hemmung der Hämolyse durch den Extrakt wurde wie folgt berechnet:

wobei Ab1 = Absorption der Testprobe in isotonischer Lösung, Ab2 = Absorption der Testprobe in hypotonischer Lösung, Ab3 = Absorption der Kontrollprobe in hypotonischer Lösung75,85.

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden mit dem einfaktoriellen ANOVA-Test unter Verwendung der Software Sigma Stat 3.5 (Dundas Software Ltd, Toronto; Kanada) durchgeführt. P-Werte ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Fachbereich Physik, Fakultät für Naturwissenschaften, Al-Azhar-Universität, (Mädchenabteilung), Postfach 11884, Kairo, Ägypten

Safaa Saleh & Amira M. Ali

Abteilung für Zellulose und Papier, Nationales Forschungszentrum, 33 El-Bohouth St., Dokki, PO 12622, Gizeh, Ägypten

Ahmed Salama und Ahmed K. Saleh

Abteilung für Polymere und Pigmente, Nationales Forschungszentrum, 33 El-Bohouth St., Dokki, PO 12622, Gizeh, Ägypten

Bothaina Abd Elhady & Emad Tolba

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SS, AMA: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Verfassen des Originalentwurfs. A.Salama, A.Saleh, ET: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. BAE: Untersuchung, formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Ahmed K. Saleh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Saleh, S., Salama, A., Ali, AM et al. Ägyptischer Propolis-Extrakt zur Funktionalisierung von porösem Cellulose-Nanofaser/Poly(vinylalkohol)-Hydrogel sowie zur Charakterisierung und biologischen Anwendungen. Sci Rep 13, 7739 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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